Уже многие годы в СМИ то и дело появляются статьи о том, что учёные в той или иной стране совершают открытие, вот-вот должное привести к окончательной победе над злокачественными новообразованиями, в быту именуемыми раком. Но, к сожалению, всякий раз оказывается, что этот грозный недуг не собирается сдавать позиции, так что невольно задашься вопросом: “сколько же еще открытий нужно сделать, чтобы окончательно побороть неизлечимую до сих пор болезнь?”.
Эффективным орудием науки и медицины в решении задач по борьбе не только с онкологическими заболеваниями, но и с инфекционными, паразитарными и многими другими, а также для решения многих других фундаментальных проблем, является целое методическое направление — проточная цитометрия. В основе метода лежит измерение оптических параметров клетки при прохождении через нее лазерного луча. Поскольку, как известно, абсолютно прозрачных клеток не существует, каждая из них так или иначе рассеивает попадающий на нее свет. Степень светорассеяния при этом позволяет оценить не только размеры клеток, но и их внутреннюю структуру. Кроме того, при анализе образца учитывается уровень флуоресценции собственных структур клетки (аутофлуоресценция) или флуорохромов, внесенных в образец (окраска флуоресцентными антителами). Эти возможности реализованы в созданных недавно «сортерах», способных отделить от общей смеси клетки с уникальными свойствами. Трудно сказать, сколько времени потребовалось бы исследователю, если бы он взялся вручную искать среди миллиона клеток ту единственную, которая обладает именно теми свойствами, которые его интересуют. А при использовании сортера такая задача много времени не займет. Один из приборов, позволяющих проводить операцию по сортировке клеток, находится на биологическом факультете МГУ, в лаборатории проточной цитофлуориметрии и сортировки клеток, возглавляемой профессором, доктором биологических наук Иваном Андреевичем Воробьевым.
Созданная в рамках Программы развития МГУ, лаборатория располагает комплексом приборов, позволяющими проводить все операции по сортировке клеток.
Итак, показателями, позволяющими прибору различать клетки между собой, являются их флуоресцентные и светорассеивающие свойства. Установка оснащена шестью лазерами, что дает возможность тонко задавать необходимые параметры, свойственные, например, опухолевым клеткам, или лимфоцитам определенного типа, и выделить их из изначальной смеси.
Флуоресценция — процесс свечения вещества, вызываемый возбуждающим светом. К ней способны далеко не все вещества, обладающие флуорофорными группами. Однако многие биологические структуры имеют их в своем составе. Лазерное излучение, попавшее на флуорофор, им поглощается, и вызывает свечение с большей длиной волны, которое впоследствии улавливаться детектором.
Процесс разделения клеток происходит следующим образом: заранее изготовленную суспензию клеток помещают в пробоотборник, после чего по системе трубочек суспензия перемещается в центральную кювету прибора. Далее с помощью тонкой иглы суспензия впрыскивается в постоянно текущую струю омывающей жидкости. Специальный носик «дробит» струю таким образом, что в каждой капле находится ровно по одной клетке. На определенном участке пути установлен лазер, просвечивающий пролетающие мимо клетки. Свет лазера, слегка измененный клеткой, через которую он прошел, попадает на детектор, который регистрирует его параметры. Другой существенной частью прибора является камера, изображение с которой выводится на управляющий монитор, настроенная так, что с помощью нее прибор «знает» о положении каждой отдельной клетки, прошедшей лазер.
Чтобы добиться такой высокой точности, помещение с оборудованием поддерживают в условиях постоянной температуры и влажности, так как даже небольшое колебание условий изменяет параметры образования капель из непрерывной струи, что сильно затрудняет сортировку.
Само разделение клеток проводится с помощью двух металлических пластин под напряжением в 4000 вольт, между которыми пролетают капли. В зависимости от «решения» прибора капля предварительно заряжается. Заряженная капля, пролетая между пластинами, отклоняется в ту или иную сторону в зависимости от заряда. Максимальная скорость такой сортировки – 20000 клеток в секунду.
Прибор, уникальный не только для России, но и для стран СНГ, пользуется большой популярностью среди исследователей из ведущих научных центров Москвы. На нем работают сотрудники различных кафедр биологического факультета МГУ и различных институтов РАН, например, ИБХ им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова .
Комплекс оборудования успешно применяется для решения задач области фундаментальной науки. Наиболее часто решаемой задачей становится окрашивание клеток сразу несколькими флуоресцентными метками для исследования различных клеточных структур. Однако сразу все метки несет ничтожно малое количество клеток, и такие клетки необходимо отсортировать, прежде чем ставить с ними эксперименты.
GFP — (англ. green fluorescent protein) Зеленый флуоресцентный белок, имеющий в своем составе флуоресцирующую зеленым светом структуру. Часто используется в качестве светящейся метки в различных исследованиях на клеточном и молекулярном уровнях. Методами генной инженерии на основе GFP созданы белки, имеющие и другие цвета флуоресценции.
Одной из уже успешно выполненных работ является исследование, посвященное –лимфомам – опухолям из лимфоидной ткани.
Лимфомы — разновидность злокачественных опухолей, поражающих лимфоидные ткани, в частности, лимфоциты.
Сотрудники И.А. Воробьева Изучали профиль экспрессии РНК, кодирующих белки, ответственные за передачу сигналов. Согласно общепринятой в настоящее время концепции, первопричиной опухоли является ее неадекватная реакция на сигналы организма, или же ее полное отсутствие. Неконтролируемое деление клеток является лишь следствием некорректной межклеточной коммуникации. Задачей сортировки в этом исследовании являлось разделение здоровых и опухолевых клеток для последующего отдельного измерения экспрессии в них изучаемых учеными белков. Одним из таких белков является циклин Д, ген которого, перемещаясь на другую хромосому из нормального положения, начинает бесконтрольно экспрессироваться, что считается основным условием для появления опухоли – так называемой лимфомы из клеток мантийной зоны.. Однако медикам известны лимфомы с очень похожей клинической картиной, в которых нет такой мутации. С помощью выделения на сортере опухолевых популяций было выяснено, что экспрессия гена циклина Д повышена и там. Возможна и обратная ситуация: «одинаковые» с точки зрения врача опухоли могут возникать у разных пациентов из-за разных нарушений. Поэтому, чтобы не ошибиться, программу лечения приходится подбирать индивидуально для каждого случая, что требует детальной характеристики клеток пациента, которую можно получить методом проточной цитометрии.
Интересна и выполняемая в лаборатории совместно с Гарвардской медицинской школой работа с так называемыми микрочастицами. Микрочастицы были открыты еще в 1946 году, но лишь недавно стали объектом активных исследований. Они представляют собой мембранные пузырьки диаметром в 0,1-1 микрон с разнообразным содержимым. Поскольку микрочастицы выделяются многими клетками организма в кровоток, также называют — экзосомами, хотя это название и не прижилось. Функциональная нагрузка таких образований ясна не полностью, но уже известно, что по содержимому микрочастиц можно выяснить, какие конкретно клетки их выделяли. Известно также и то, что они ответственны за интеграцию поведения клеток в организме. Клетки злокачественных новообразований также их выделяют, и анализ по микрочастицам позволяет локализовать опухоль в случае неоднозначности ее местоположения. Отделить микрочастицы от всего остального помогает все тот же метод сортировки клеток.
Помимо борьбы со злокачественными образованиями, сегодня актуальна разработка средств лечения паразитарных заболеваний, например, малярии. До сих пор не изобретен эффективный способ лечения данного заболевания, каждый год уносящего жизни минимум миллиона человек. С точки зрения исследований, направленных на борьбу с малярией, интересна только одна стадия жизненного цикла малярийного плазмодия, возбудителя заболевания. Приборы для клеточной сортировки пригодились и здесь, поскольку позволяют выделить из больного организма клетки, пораженные искомой формой плазмодия.
Из всего вышесказанного можно смело сделать один вывод: применять метод проточной цитометрии можно во многих исследованиях, как в фундаментальных, так и в приближенных к практике. Лаборатория охотно предоставляет свое оборудование тем, кому необходимо использовать его в своих работах, так что сфера применения сортера ограничена только лишь фантазией исследователей.
Авторы текста: Богдан Кириленко, Артемий Третьяков.
