Такие транслокации зачастую возникают при химиотерапии опухолей и приводят к развитию других онкологических заболеваний в частности, лейкозов (рак крови). Что определяет, какая именно транслокация произойдет, известно не было. Учёные выяснили, что в этом процессе важную роль играет расхождение концов ДНК в месте разрыва. Полученные результаты можно будет использовать для снижения побочных эффектов противораковой терапии. Исследование проходило при поддержке Минобрнауки РФ (соглашение № 075-15-2021-1062) в рамках Национального проекта «Наука и университеты» и было опубликовано в журнале International Journal of Molecular Sciences.
Опухолевые клетки активно делятся. Но перед делением им необходимо распутать молекулы ДНК, которые при репликации оказываются сильно переплетены. Для распутывания переплетенных молекул ДНК в клетке используются ферменты топоизомеразы, которые распутывают узлы, разрезая молекулы ДНК, а потом сшивая обратно. Быстро делящимся клеткам, таким как раковым, крайне важна правильная работа топоизомераз. Один из подходов современной химиотерапии базируется именно на блокировании работы топоизомераз с помощью специальных молекул — ингибиторов топоизомераз. При такой терапии раковые клетки погибают от множественных разрывов ДНК, что приводит к постепенному выздоровлению пациента.
Однако ингибиторы блокируют работу топоизомераз не только в раковых клетках, но и в здоровых, и в них тоже возникают повреждения ДНК. В таких случаях ферменты системы репарации пытаются эти повреждения залатать. Так как клетке важно сделать это как можно быстрее, чаще всего поврежденные концы просто соединяются вместе. Однако это может приводить к ошибкам, например, объединению фрагментов разных хромосом, из-за чего возникают хромосомные транслокации. Такие клетки могут стать раковыми, и у пациентов развивается острый лейкоз — рак крови, который также называют вторичным, так как он возник в результате лечения. При вторичных лейкозах у разных пациентов обнаруживается довольно узкий набор хромосомных транслокаций, что говорит о существовании механизмов, определяющих возникновение именно таких перестроек. В частности, при вторичном лейкозе часто обнаруживается транслокация между 8 и 21 хромосомами, соединяющая гены AML1 и ETO.
О механизмах, определяющихкакие именно хромосомные перестройки возникнут в клетках после возникновения разрывов ДНК, существуют две гипотезы. Первая постулирует, что транслокации обычно возникают между локусами – участками хромосом – которые находятся близко друг к другу в ядре. Во второй гипотезе определяющим фактором для транслокаций считают вызванную двуцепочечными разрывами ДНК подвижность, позволяющую встретиться любым локусам из двух разных хромосом.
Команда исследователей под руководством сотрудников биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова решила подробнее рассмотреть факторы, приводящие к таким транслокациям. При помощи как биохимических методов исследования пространственной организации генома, так и методов микроскопии, они смогли получить данные о том, какие хромосомы контактировали между собой и как повлияли вызванные ингибитором топоизомераз разрывы ДНК на ее подвижность.
Результаты показали, что на возникновение транслокаций в большей степени влияет то, что в местах разрывов ДНК концы разрыва иногда «теряются», расходясь на значительное расстояние. Вероятно, расхождение разрывов, вызванных ингибиторами топоизомераз, связано с тем, что их устранение является сложным процессом и требует длительного времени, за которое концы успевают разойтись. Поэтому такие концы являются более подвижными, в результате чего фрагмент хромосомы может выйти за пределы своей хромосомной территории — места, в котором эта хромосома находится в норме.
Исследование проводили на специальных бессмертных Т-лимфоцитах – стандартных объектах для изучения лейкоза. Клетки обрабатывали этопозидом – ингибитором топоизомераз. Для обнаружения концов разрывов в гене AML1 в ядре применялся метод флуоресцентной in situ гибирдизации (FISH) с использованием ДНК-зондов, комплементарным разным концам этого гена. ДНК-зонды содержат в себе флуоресцирующие молекулы, которые позволяют визуализировать нужные локусы при наблюдении клеток в микроскоп.
С помощью такой методики удалось увидеть, что обработка Т-лимфоцитов этопозидом привела к образованию двуцепочечных разрывов, а также к расхождению концов разрывов ДНК в гене AML1. При помощи компьютерного анализа изображений с микроскопа учёные измерили расстояния между геном AML1 и хромосомной территорией 21 хромосомы, в которой в норме находится данный ген. Оказалось, что гены, в которых возникли разрывы, чаще находились за пределами своей хромосомной территории. Затем при помощи метода 4С авторы смогли определить, что будущие “партнёры” по транслокациям (например, гены AML1 и ETO) не находились в ядре рядом друг с другом до возникновения разрывов.
«Особенностью работы можно считать применение как биохимических методов (4С) для выявления частот контактов генов между собой, так и микроскопических методов (FISH) выявления разрывов гена и его местоположения относительно хромосомной территории, — поясняет первый автор исследования, научный сотрудник кафедры молекулярной биологии биологического факультета МГУ Николай Ломов. — Результаты работы дают основание полагать, что в случае воздействия на клетки этопозидом, быстрая репарация разрывов ДНК затруднена, и концы разрыва «теряются» в пространстве ядра. Из-за этого повышается вероятность их встречи с концом другого такого же разрыва. И по всей видимости, в этом случае не так важно, где исходно располагались гены-партнеры по транслокации. Гораздо важнее, какие из генов более подвержены действию этопозида. Понимание механизмов образования транслокаций может помочь в борьбе с такими негативными эффектами химиотерапии, как развитие вторичных лейкозов».
В исследовании также принимали участие сотрудники института биологии гена РАН, Первого МГМУ имени И.М. Сеченова и Венского медицинского университета (Австрия).
