Результаты показали, что использование версии MS2/MCP-sfGFP позволяет добиться более высокой эффективности визуализации. В ходе исследования авторы также проанализировали эффективность разных способов доставки генов гидовых РНК: лентивирусную трансдукцию и транзиентную трансфекцию. Первый подход показал лучшие результаты. По итогам работы был составлен список границ топологически ассоциированных доменов (ТАДов), для исследования которых может использоваться технология CRISPR-Sirius. Результаты научной работы опубликованы в журнале Cells.
Как известно, наследственная информация закодирована в последовательностях молекул ДНК, суммарный размер которых составляет в клетках человека около двух метров. Чтобы ДНК могла поместиться в клеточном ядре, она подвергается значительной компактизации с участием различных белков. Совокупность ДНК и взаимодействующих с ней белков называют хроматином. К настоящему времени ясно, что хроматин представляет собой не случайный запутанный клубок из ДНК и белков, а является сложной и иерархически организованной системой. Более того, такая система обладает большой динамикой: участки хроматина могут перемещаться внутри ядра, взаимодействовать друг с другом и другими внутриядерными структурами. Такая динамика важна для регуляции экспрессии генов, репликации и устранения повреждений в молекулах ДНК (репарации).
Для изучения динамики хроматина необходимы методы, которые позволят визуализировать точечные локусы хроматина (например, отдельные гены или регуляторные элементы генома) и следить за их движениями в ядре живой клетки.
К таким методам относят недавно описанную технологию (систему визуализации) CRISPR-Sirius. Эта система состоит из трех компонентов. Первый компонент – это каталитически неактивный вариант нуклеазы Cas – dCas9. Второй компонент – это гидовая РНК, которая направляет dCas9 на целевой локус хроматина. В системе CRISPR-Sirius гидовая РНК содержит восемь шпилек бактериофагов MS2 или PP7. Такие шпильки узнаются белками MCP и PCP, соответственно, которые соединены с флуоресцентным белком (например, sfGFP). Таким образом, при экспрессии в клетке всех трех компонентов – dCas9, гидовой РНК и белков MCP или PCP – на целевом локусе образуется флуоресцентный комплекс, который делает этот локус видимым при микроскопии.
Несмотря на подтвержденную эффективность описанного метода, необходимы исследования, которые бы сравнили работу системы CRISPR-Sirius в зависимости от выбора одного из белков: MCP или PCP. Используя набор из нескольких целевых локусов, коллектив ученых кафедры молекулярной биологии МГУ сравнил эффективность этих двух версий системы. Сотрудники также проанализировали эффективность двух разных способов доставки генов гидовых РНК в клетки — при помощи лентивирусной трансдукции и транзиентной трансфекции (липофекции). Первый метод состоит в доставке материала при помощи лентивирусных частиц, второй — с использованием липидных везикул.
Оказалось, что система CRISPR-Sirius с использованием MS2 шпилек в гидовой РНК и белка MCP-sfGFP позволяет добиться значительно более высокой эффективности визуализации целевых локусов, чем версия PP7/PCP-sfGFP. Ученые также определили, что к лучшим результатам приводит доставка генов гидовых РНК при помощи лентивирусных частиц. В ходе работы был определен набор локусов – границ топологически ассоциированных доменов, которые могут быть визуализированы с помощью технологии CRISPR-Sirius. Топологически ассоциированные домены (ТАДы) представляют собой базовую единицу компактизации хроматина в клетках человека и других животных. Использование технологии CRISPR-Sirius для визуализации ТАДов в будущем позволит лучше понять закономерности образования этих структур и механизмов компактизации и динамики хроматина в целом.
«Несмотря на то, что технологии визуализации хроматина в живых клетках активно развиваются в последние годы, эффективность их применения на практике может быть довольно низкой. Такие технологии требуют доставки в клетки и экспрессии нескольких генов (dCas9, гидовые РНК, флуоресцентные белки..), выбора подходящих целевых локусов, подбора условий микроскопии живых клеток. Оптимизация этих параметров представляет собой трудоемкий процесс, и нам потребовалось без малого два года, чтобы добиться эффективной визуализации при использовании технологии CRISPR-Sirius. Ранее эта технология была опубликована в высокоимпактном журнале, но мы поняли, что ряд практических аспектов её применения остался недостаточно освещен. В нашей работе мы описали подводные камни, связанные с применением технологии CRISPR-Sirius, выбрали наиболее эффективный вариант этой системы и предложили список локусов – границ топологически ассоциированных доменов, которые могут быть успешно визуализированы с использованием данной технологии. Наша публикация и носит достаточно технический характер, но мы уверены, что она полезна широкому кругу исследователей, занимающихся синтетической биологией и визуализацией хроматина», — подводит итог Владимир Вьюшков, научный сотрудник кафедры молекулярной биологии биологического факультета МГУ.
Источник: msu.ru
